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La aplicación rápida de ceftiofur de acción prolongada puede prevenir pérdidas en cerdos por muertes asociadas con Streptococcus equi subespecie zooepidemicus

Streptococcus equi subespecie zooepidemicus es un patógeno zoonótico que causa infecciones en una variedad de especies de mamíferos, incluidos los cerdos.

Históricamente, la infección por S. equi subsp zooepidemicus ha sido esporádica en cerdos en EE.UU.; sin embargo, en 2019, se produjeron múltiples introducciones de una nueva cepa de S. equi subsp zooepidemicus en EE.UU. y dio como resultado una mortalidad que alcanzó entre el 30-50% en los grupos de animales afectados. Los animales enfermos tenían signos clínicos que incluían fiebre, letargo severo y renuncia a levantarse. Se observaron signos clínicos similares durante la replicación experimental de la enfermedad, que progresó rápidamente y condujo a una mortalidad del 100% a las 72 horas tras la infección.

Actualmente, ningún estudio in vivo ha evaluado el uso de antimicrobianos como estrategia de intervención para la infección por S. equi subsp zooepidemicus en cerdos. Aunque los aislamientos de S. equi subsp zooepidemicus, incluidas las cepas de 20193, son en gran medida susceptibles a los antibióticos B-lactámicos, la rápida progresión de la enfermedad podría evitar que el tratamiento con antibióticos controle las pérdidas asociadas con la introducción de S. equi subsp zooepidemicus en una granja de cerdos.

En este estudio, investigaron el uso de ceftiofur de acción prolongada como una estrategia de intervención para controlar la infección por S. equi subsp zooepidemicus en cerdos. El objetivo fue determinar si la aplicación rápida de ceftiofur después del desarrollo de signos clínicos podría prevenir las pérdidas asociadas con la infección por S. equi subsp zooepidemicus.

MATERIALES Y MÉTODOS

Estudio de animales

39 cerdos de 10 semanas de edad se dividieron en 3 grupos. Los animales del grupo 1 fueron desafiados con S. equi subsp zooepidemicus (n=16). Los animales del grupo 2 fueron desafiados con S. equi subsp zooepidemicus y tratados con una dosis calculada en peso de ceftiofur (Excede; Zoetis) administrada por vía intramuscular (n=16). Los animales del grupo 3 no fueron desafiados (n=7). Los animales de los grupos 1 y 2 fueron inoculados por vía intranasal y oral con 3ml de 2×108 unidades formadoras de colonias (UFC)/ml (1ml por fosa nasal y 1ml por vía oral). Los animales del grupo 2 se trataron con ceftiofur tras el desarrollo de signos clínicos el día 1 después de la exposición y nuevamente el día 5 después de la exposición, cuando las fiebres comenzaron a reaparecer. Se administró un 3º tratamiento solo a los animales que desarrollaron fiebre después del nuevo tratamiento. La temperatura corporal se controló 2 veces al día después de la prueba con un chip de temperatura (Destron Fearing). Después del desafío, los animales fueron controlados cada 4 horas, excluyendo un período nocturno de 8 horas, para el desarrollo de signos clínicos que incluyen depresión, reticencia a levantarse y signos neurológicos. Los cerdos fueron sacrificados y se les realizó la necropsia cuando los signos clínicos se volvieron graves. En la necropsia, se recogieron las siguientes muestras para cultivo: hisopo nasal, hisopo de tonsilas, hisopo de serosas, hisopo hepático, hisopo esplénico, líquido articular, líquido cefalorraquídeo (LCR), líquido de lavado broncoalveolar y suero. Se recogieron hisopos nasales y tonsilares a los 7 y 30 días después de la exposición en los animales supervivientes para evaluar la colonización.

En el día 30 posterior al desafío, 2 animales (692 y 697) que habían sido tratados solo 2 veces con ceftiofur se mezclaron con 3 animales control negativo del grupo 3 en una sala limpia, con el fin de evaluar la transmisión de animales recuperados a contactos esporádicos después del tratamiento. Para dar tiempo al desarrollo de la respuesta serológica, los animales fueron monitoreados en busca de signos clínicos, como se describió previamente hasta el día 63, cuando fueron sacrificados. En la necropsia, se recogieron muestras para detectar S. equis subsp zooepidemicus.

Aislamiento bacteriano y condiciones de cultivo

Streptococcus equi subsp zooepidemicus 19-031482-K1916623-LUNG1 (SRR10584760) fue aislado de un caso de alta mortalidad en Tennessee (EE.UU.) en 2019. S. equi subsp zooepidemicus se sembró en agar tripticasa soja con sangre de oveja al 5% (Becton Dickinson) a 37ºC con 5% de CO2. Los cultivos de S. equi subsp zooepidemicus se mantuvieron durante la noche en solución salina tamponada con fosfato a una DO600=0,42, lo que da como resultado 108 a 109 CFU/mL. La concentración final de S. equi subsp zooepidemicus en el inóculo se cuantificó mediante diluciones seriadas en placas. Se confirmó que las colonias sospechosas eran S. equi subsp zooepidemicus mediante ionización/desorción láser asistida por matriz con tiempo de vuelo (MALDI-TOF) en los laboratorios de los Servicios Veterinarios Nacionales en Ames, Iowa, EE.UU.

Evaluación de anticuerpos séricos

El suero se recogió en el momento de la exposición y el día 30 después de la exposición en los grupos 1, 2 y 3. Se recogió de los cerdos en contacto el día 0 (desafío), el día 30 (mezcla) y el día 63 (aproximadamente cuatro semanas después de la exposición). Todo el suero se almacenó a -80°C hasta que se realizaron las pruebas de ELISA. Para el ELISA, se recubrieron placas de 96 pocillos con una dilución 1:10 de S. equi subsp zooepidemicus desactivados por calor (DO600=0,6) en tampón de carbonato-bicarbonato. El título se determinó diluyendo en serie el suero porcino. El anticuerpo se detectó utilizando un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa para la cadena pesada de inmunoglobulina porcina (dilución 1:20 000; SeraCare Life Sciences Inc) y sustrato de tetrametilbencidina (Life Technologies). La densidad óptica se midió a 450nm con corrección a 655nm. Los datos se modelaron con la función no lineal del log10 dilución y el modelo logístico de 4 parámetros de pendiente variable logarítmica (agonista) versus respuesta en GraphPad Prism (Software GraphPad) con título de punto final interpolado utilizando 2 veces la lectura promedio para suero porcino gnotobiótico.

Análisis estadístico

El análisis estadístico se completó en GraphPad Prism 8. El análisis de supervivencia se realizó mediante el método de límite de producto de Kaplan y Meier, comparando las curvas de supervivencia utilizando la prueba de rango logarítmico. Los títulos de anticuerpos se convirtieron a valores de log10 y se compararon usando un análisis de varianza de 2 vías. Se consideró estadísticamente significativo un valor de p≤0,05.

RESULTADOS

Progresión clínica y supervivencia

El desafío de los cerdos resultó en el desarrollo de la enfermedad 24 horas después de la inoculación (anorexia, fiebre y depresión) en los animales del grupo 1 y 2. No se desarrollaron signos clínicos en animales no desafiados (grupo 3). Después de la identificación de la enfermedad clínica, los animales del grupo 2 fueron tratados con 1 dosis de ceftiofur calculada en peso. La mayoría de los cerdos (15 de 16) volvieron a tener un comportamiento normal y una temperatura corporal normal 24 horas después del tratamiento (Figura 1). Un animal (695) en el grupo 2 desarrolló signos neurológicos (incapaz de levantarse, atáxico) después del tratamiento y fue sacrificado 72 horas después del desafío (Figura 2).

S. equi subsp zooepidemicus se aisló de la muestra de LCR pero no se encontró en la otras muestras recogidas. El día 5 después de la exposición (4 días después del tratamiento), los cerdos volvieron a desarrollar signos clínicos. Fueron tratados por 2ª vez y las temperaturas y el comportamiento volvieron a la normalidad. Se requirió un 3º tratamiento en 7 de los 15 animales supervivientes en el grupo tratado, ya que se volvieron febriles entre 10 y 11 días después de la exposición. Después del 3º tratamiento, los animales no desarrollaron más signos de enfermedad, aunque las fluctuaciones de temperatura fueron habituales (Figura 1).

En contraste con los animales del grupo 2, los animales del grupo 1 se deterioraron rápidamente sin intervención de antibióticos y 15 de 16 cerdos fueron sacrificados 72 horas después del desafío (Figura 2). Se aisló S. equi subsp zooepidemicus de diferentes localizaciones en todos los animales no tratados sacrificados durante la fase aguda de la infección.

Se tomaron hisopos nasales y tonsilares los días 7 y 30 después de la exposición para evaluar la colonización. El día 7, no se aisló S. equi subsp zooepidemicus de ninguno de los animales supervivientes del grupo 2 (n=15). S. equi subsp zooepidemicus se aisló de hisopos nasales del animal superviviente no tratado (grupo 1, n=1). Para el día 30 después del desafío, S. equi subsp zooepidemicus no se aisló de ninguno de los animales sobrevivientes en el grupo 1 (n=1) o el grupo 2 (n=15).

Mezcla con animales de contacto

En el día 30 posterior al desafío, 3 cerdos sin tratamiento previo de los controles no expuestos (grupo 3) se mezclaron con 2 animales tratados y expuestos (grupo 2) que solo habían recibido 2 dosis de ceftiofur. Ninguno de los cerdos mezclados mostró cambios de comportamiento después de la mezcla consistentes con la enfermedad que produce S. equi subsp zooepidemicus; sin embargo, desarrollaron fiebre transitoria (>40ºC; Figura 3), que duró de 36 a 60 horas. El día 11 después de la mezcla, todas las temperaturas volvieron a la normalidad y permanecieron normales hasta el final del estudio. En la necropsia, los hisopos nasales y tonsilares de los animales en contacto fueron negativos en el cultivo.

Evaluación de los títulos de anticuerpos séricos

Todos los grupos tenían títulos similares a S. equi subsp zooepidemicus antes del desafío. A los 30 días después de la exposición, se observó un aumento estadístico en el título en el grupo 2 (15 de 16) y en el animal superviviente no tratado en el grupo 1 ( P<0,001; Figura 4). El título de los animales tratados fue comparable al del animal superviviente no tratado el día 30 (p=0,47). No se observó ningún aumento en el título en los cerdos en contacto después de la mezcla (P=0,07).

DISCUSIÓN

En 2019, la introducción de S. equi subsp zooepidemicus en grupos de cerdos no expuestos en Norteamérica provocó una enfermedad sistémica grave y una mortalidad que alcanzó entre el 30% y el 50%. En este estudio, evaluamos la intervención con antibióticos para prevenir pérdidas graves por muerte asociadas con la infección por S. equi subsp zooepidemicus. Utilizamos ceftiofur inyectable de acción prolongada, ya que se descubrió que los aislamientos de S. equi subsp zooepidemicus de Norteamérica de 2019 eran susceptibles a los antibióticos betalactámicos (Figura 4).

En animales no tratados, el desafío con S. equi subsp zooepidemicus produjo signos clínicos y mortalidad consistentes con investigaciones previas. Todos los animales desafiados desarrollaron rápidamente la enfermedad clínica y 15 de los 16 animales no tratados fueron sacrificados dentro de las 72 horas posteriores al desafío. Sin embargo, el tratamiento con ceftiofur tras la identificación de la enfermedad clínica mejoró la supervivencia (15 de 16 animales sobrevivieron) y los signos clínicos se resolvieron por completo durante 3 días. Aunque fue necesario repetir el tratamiento, los animales se estabilizaron 15 días después de la exposición y ningún animal requirió más de 3 tratamientos con ceftiofur (12-18 días de niveles plasmáticos terapéuticos según la información del producto). Además, al evaluar los títulos de anticuerpos, los cerdos tratados desarrollaron títulos similares a los del cerdo superviviente no tratado 30 días después de la exposición. Esto indica que la estimulación inmunitaria fue suficiente para desarrollar una respuesta inmunitaria adaptativa incluso con tratamiento antibiótico.

Un animal del grupo tratado desarrolló signos neurológicos y fue sacrificado después del 1º tratamiento con antibióticos. S. equi subsp zooepidemicus se aisló del LCR del animal, pero no de ninguna de las otras muestras recogidas. Esto puede deberse a que S. equi subsp zooepidemicus ya había cruzado la barrera hematoencefálica en el momento del tratamiento y el tratamiento pudo eliminar S. equi subsp zooepidemicus de otras localizaciones, pero no dentro del sistema nervioso central. Esto indica la importancia de la detección temprana de la enfermedad y el rápido inicio del tratamiento para prevenir las pérdidas de S. equi subsp zooepidemicus.

Para evaluar si los cerdos tratados podrían servir como reservorio de la infección en animales no tratados introducidos después de la estabilización de S. equi subsp zooepidemicus, mezclamos 3 de los cerdos control no expuestos con dos cerdos que se recuperaron después de 2 tratamientos con ceftiofur. Ningún animal en contacto desarrolló anorexia o depresión; sin embargo, los 3 desarrollaron una fiebre transitoria entre el día 1 y el 11 después de la mezcla que duró de 36 a 60 horas. Las temperaturas máximas no fueron tan altas en los cerdos en contacto como se observaron en los cerdos expuestos primariamente (promedio de 41,04°C frente a 41,75°C, respectivamente), lo que podría deberse a una dosis de exposición menor. Además, se evaluaron los títulos para detectar un caso de exposición. La ausencia de un aumento en los títulos indica que la exposición a S. equi subsp zooepidemicus en los cerdos es contacto no estimuló una respuesta inmunitaria adaptativa. En otro estudio, observamos que la mezcla de cerdos no tratados que sobrevivieron a un desafío frente a S. equi subsp zooepidemicus con cerdos en contacto sin tratamiento previo condujo a la transmisión en 2 de los 3 animales, uno de los cuales desarrolló una enfermedad grave. En general, los datos de este estudio no respaldan un gran riesgo de exposición de animales tratados previamente infectados. En nuestro experimento, el corral se mantuvo con un alto nivel de higiene y los animales se trasladaron a una sala limpia para la evaluación de la mezcla, lo que minimizó la posibilidad de exposición ambiental.

En general, este estudio indicó que el tratamiento temprano de animales infectados con S. equi subsp zooepidemicus con ceftiofur inyectable puede reducir los signos clínicos, reducir la mortalidad y proporcionar tiempo para que el sistema inmunitario responda con una respuesta inmunitaria adaptativa. Si bien usamos ceftiofur, no hay razón para esperar que el tratamiento con otros antibióticos B-lactámicos durante la misma duración proporcione una eficacia diferente. Es importante dar el tratamiento rápidamente después de la detección de signos clínicos. Es esencial aplicar el tratamiento por vía parenteral cuando hay signos clínicos, porque los animales gravemente enfermos no comen ni beben, por lo que los antibióticos añadidos en el alimento o el agua serían ineficaces.

Autores: Samantha J. Hau; Alexandra Buckley; Susan L. Brockmeier. National Animal Disease Center, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, Ames, Iowa.

Fuente: Anaporc


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