En 2014 se propusieron piensos e ingredientes de piensos como vehículos para el transporte y transmisión del virus de la diarrea epidémica porcina (PEDv) de China a EE.UU. Desde entonces, esta hipótesis se ha expandido a múltiples virus, como el virus Séneca-A (SVA), el virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSv), el virus de la peste porcina clásica (PPC), el virus de la pseudorrabia y el virus de la peste porcina africana (PPA). Estos estudios también han confirmado repetidamente que ciertos ingredientes del alimento, como los productos a base de soja, parecen promover la supervivencia del virus a lo largo del tiempo. Para mitigar este riesgo, la industria porcina de América del Norte ha intentado reducir la viabilidad del virus en los piensos utilizando una variedad de enfoques, incluida la reducción mecánica (lavado y secuenciación), tratamiento térmico, granulación, mitigación química y almacenamiento prolongado. Este último enfoque es un componente crítico de la política de importaciones responsables, un protocolo basado en la evidencia científica para introducir, de manera segura, los ingredientes esenciales de los alimentos provenientes de países de alto riesgo utilizando períodos prolongados de almacenamiento en condiciones climáticas controladas para reducir la viabilidad del virus. En este sentido, la Agencia Canadiense de Inspección de Alimentos ha adaptado los requisitos de importación de ingredientes de piensos seleccionados de países endémicamente infectados con el virus de la PPA y se ha producido una aplicación voluntaria a gran escala de importaciones responsables en toda la industria porcina de EE.UU. Estos protocolos implican el almacenamiento de ingredientes de piensos importados en instalaciones designadas durante un período predeterminado y mantenidos a una temperatura controlada, antes de su traslado a los molinos y a las granjas. Sin embargo, aunque se aplican ampliamente, estos protocolos se han basado principalmente en estimaciones matemáticas de la vida media, no en datos obtenidos experimentalmente.
Para abordar esta limitación, diseñamos un experimento utilizando un enfoque tomado de las ciencias sociales conocido como el “Proyecto de demostración”. Un proyecto de demostración se define como un medio para promover innovaciones y difundir las mejores prácticas a través del desarrollo y análisis de un proyecto en vivo, realizado en entornos naturales, que se asemejan a las condiciones del mundo real no experimentales.
Este enfoque se ha utilizado para ayudar a construir una base de evidencia para respaldar las mejoras de la industria ya que, históricamente, las lecciones aprendidas de las demostraciones, a través de los rigores de la investigación científica, han dado como resultado una adopción a gran escala y cambios importantes en los objetivos, estilos y recursos. Por lo tanto, el propósito de este estudio fue diseñar un proyecto de demostración para probar el efecto de un protocolo de almacenamiento extendido sobre la supervivencia de patógenos virales porcinos en ingredientes de piensos compuestos en condiciones reales. El estudio se basó en la hipótesis de que controlar la temperatura durante el almacenamiento mejoraría el éxito del protocolo.
MATERIAL Y MÉTODOS
Preparación de la muestra
Los virus seleccionados para este estudio incluyeron PRRSv-174, PEDv y SVA, mientras que los ingredientes incluyeron harina de soja convencional, harina de soja orgánica, cloruro de colina (60%, sin portador de mazorcas de maíz), lisina HCL (78,8% mínimo de lisina, sin portador) y vitamina A (1.000.000 UI con gelatina de porcino recubierta). Como se definió anteriormente, la harina de soja convencional contenía un contenido bajo en grasas (1%-2%) y alto en proteínas (46%-47%), mientras que el producto orgánico tenía mayor contenido de grasas (6%-7%) y menor contenido de proteínas (44%-45%). Se obtuvieron muestras de cada ingrediente de molinos locales y no se irradiaron antes de iniciar el estudio. Se pesaron 4 asignaciones de 30g de los 5 ingredientes en tubos de minibiorreactor individuales de 50ml con tapas ventiladas para un total de 20 muestras, proporcionando 4 réplicas por cada uno de los 5 ingredientes. Esto se definió como un conjunto de muestra. Para la preparación del inóculo viral, se preparó un solo lote de inóculo viral que contenía una mezcla de los 3 virus. Específicamente, cada virus se diluyó en 100ml de medio esencial mínimo (MEM), a una concentración de 1×105 dosis infecciosa de cultivo de tejidos al 50% por ml por virus. A continuación, se mezclaron los 3 virus (3 virus para un total de 300ml) seguido de una adición de 200ml de MEM, para llevar el volumen total a 500ml. Esta concentración se basó en una publicación anterior que documentaba este nivel de PEDv en muestras de tolvas de alimento de granjas en 2014. Cada una de las 20 muestras se enriqueció individualmente con una alícuota de 2ml de la mezcla viral para medir la carga viral al final de los 30 años, período de estudio del día. Los inóculos se inyectaron directamente en el centro de cada muestra de ingrediente de 30g utilizando una jeringa de 3ml con una aguja de calibre 18 y 3,81cm. Además de las 20 muestras enriquecidas, 2 controles positivos (mezcla de virus stock en el tubo en ausencia de alimento), 2 controles negativos (30g de harina de soja convencional, sin virus) y un control de contaminación (tubo vacío, sin alimento, sin virus) se incluyeron en el diseño.
El propósito de los controles positivos fue determinar si los virus podrían sobrevivir en ausencia de una matriz de alimentación, mientras que los controles negativos y el control de contaminación se incluyeron para validar si se produjo o no contaminación cruzada. En este estudio, se incluyeron conjuntos de muestras por duplicado, cada uno de los cuales consta de 20 muestras (4 tubos de cada uno de los 5 ingredientes) más controles, lo que da como resultado un total de 25 tubos por conjunto de muestras. El propósito de las muestras duplicadas fue evaluar la repetibilidad de los resultados.
Condiciones de almacenaje
En base a los comentarios de la industria de EE.UU., se seleccionó para este estudio un protocolo que implicaba un período de almacenamiento de 30 días a una temperatura de 20°C. El estudio se llevó a cabo en el sótano de la casa del investigador principal en el centro-oeste de Minnesota, comenzando el 31 de enero de 2020 y terminando el 29 de febrero de 2020. Para el almacenamiento al aire libre, un conjunto de muestras (como se define) se colocó a unos 2 metros fuera de la casa y de la entrada al sótano, lo que permitía la exposición a las condiciones naturales. Para el almacenamiento en interiores, el 2º conjunto de muestra se colocó en una habitación designada dentro de la casa, lo que permitió la exposición a condiciones de clima controlado generadas por el sistema de calefacción del hogar. Durante la evaluación interior, el termostato se fijó a 20°C y se programó para que permaneciera constante durante las 24 horas del día del período de almacenamiento de 30 días. Para registrar las condiciones ambientales, durante el período de 30 días, se colocó un registrador de datos junto con los conjuntos de muestras y se registró la temperatura y la humedad relativa (HR) cada 15 minutos al día.
Pruebas de diagnóstico
Una vez completado el período de almacenamiento de 30 días, las muestras se evaluaron para determinar la presencia de ARN viral mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y su viabilidad mediante un bioensayo porcino. Para la PCR, las muestras se analizaron en el Laboratorio de Diagnóstico e Investigación de Enfermedades Animales de la Universidad Estatal de Dakota del Sur, utilizando métodos publicados. Para el bioensayo, los cerdos se alojaron en las instalaciones de nivel 2 de bioseguridad. El bioensayo involucró a 50 cerdos de 3 semanas de edad, alojados en 3 habitáculos de una granja que no tenía PRRSv, PEDv y SVA. La 1ª sala fue designada para la evaluación del almacenamiento al aire libre y la 2ª para la evaluación del almacenamiento en interiores. En cada habitación, los cerdos fueron encerrados según el ingredient (5 corrales, 4 cerdos/corral, 20 cerdos/habitación). Los cerdos de control se alojaron en la 3ª habitación. Se utilizaron 5 cerdos como controles de almacenamiento al aire libre y se colocaron en la 3ª habitación, que contenía 6 corrales. Los 2 cerdos de control positivo se colocaron en el 1º corral y los 3 cerdos de control negativo en el 2º corral. Se designaron adicionalmente 5 cerdos como controles de almacenamiento en interiores y se ubicaron en la 3ª habitación con 2 cerdos de control positivo en el 5º corral y 3 cerdos de control negativo en el 6º corral.
El objetivo de los cerdos de control positivo fue determinar si el virus viable estaba presente en las muestras de control positivo (virus, sin matriz de alimento) de muestras al aire libre y muestras de interior. El objetivo de los cerdos de control negativo fue determinar si se había producido contaminación cruzada de los virus durante la manipulación de la muestra o durante el almacenamiento de muestras exteriores e interiores. Se utilizaron separadores de corrales y espacios de corrales vacíos entre los grupos de animales con el fin de eliminar el contacto “de nariz a nariz” y minimizar las posibilidades de transmisión indirecta entre corrales.
Para la preparación del inóculo de bioensayo, cada muestra de 30g de los 5 ingredientes del alimento en cada conjunto de muestras, a los 30 días después de la inoculación, se transfirió a tubos cónicos separados de 250ml, seguido de la adición de 60ml de solución salina estéril. A continuación, cada muestra se homogeneizó y se centrifugó a 4000g durante 10 minutos; se decantó el sobrenadante en un tubo limpio de 50ml y se volvió a centrifugar a 4000g durante 10 minutos. A continuación, se decantó el sobrenadante en tubos de 10ml y se congeló a -80ºC, en preparación para la inoculación. Todos los cerdos fueron inoculados con una muestra de 2ml por vía intramuscular para evaluar la infectividad de PRRSv y SVA y 2ml por vía oral para evaluar la infectividad de PEDv. Se utilizó una muestra de virus mixta para facilitar el manejo en base a la experiencia previa. Luego, se recogieron frotis rectales y muestras de sangre en los días 0, 7 y 14 después de la inoculación y se enviaron para su análisis.
RESULTADOS
Durante el período de almacenamiento de 30 días, las muestras al aire libre se congelaron rápidamente después de la colocación y permanecieron congeladas hasta que se procesaron. Por el contrario, las muestras de interior no se congelaron, aunque pareció haber alguna pérdida de volumen en las muestras de control positivo (virus stock en MEM, sin alimento), posiblemente debido a la evaporación y el secado, secundarios a las condiciones cálidas y secas del área de almacenamiento.
Presencia de ácido nucleico viral en el pienso
La carga viral media 30 días después de la inoculación en el alimento de los 3 virus y los 5 ingredientes, incluidos los controles, se resumen en la Figura 1A (almacenamiento al aire libre) y Figura 1B (almacenamiento en interiores). En ambos métodos de almacenamiento, se detectaron ARN de PRRSv, PEDv y SVA en los 5 ingredientes, observándose cierta degradación del ácido nucleico viral. Además, se detectó ARN viral en muestras de control positivo, pero no en controles negativos.
Evaluación de la viabilidad
Antes de la inoculación, se confirmó que todos los cerdos eran negativos a los 3 virus a través de muestras de suero y frotis rectales recolectados el día 0. Después de la inoculación de los cerdos con muestras de almacenamiento al aire libre de 30 días, PRRSv y ARN de SVA fueron detectados por PCR en muestras de suero y ARN de PEDv en hisopos rectales recogidos el día 7 y el día 14, después de la inoculación de cerdos de bioensayo, en el grupo de harina de soja orgánica (4 de 4 cerdos), el grupo de harina de soja convencional (4 de 4 cerdos), el grupo de vitamina A (4 de 4 cerdos), grupo de lisina (4 de 4 cerdos) y grupo de colina (4 de 4 cerdos). Además, se observaron signos clínicos importantes de PRRSv (disnea, hipertermia), PEDv (diarrea) y SVA (cojera) en todos los grupos. Los controles positivos (2 de 2 cerdos) fueron positivos para el bioensayo, mientras que los controles negativos (3 de 3 cerdos) fueron negativos para el bioensayo. Por el contrario, después de la inoculación de cerdos con muestras de almacenamiento en interiores durante 30 días, no se detectó evidencia de ARN de PRRSv, PEDv o SVA mediante PCR en muestras de suero y hisopos rectales de ninguno de los 20 cerdos de bioensayo. Además, no se observaron signos clínicos importantes de PRRSv, PEDv y SVA en ningún grupo. Los controles positivos (2 de 2 cerdos) fueron negativos al bioensayo, al igual que los 3 controles negativos.
Datos de temperatura y humedad media (HM)
En el transcurso del período de 30 días, la temperatura exterior media fue de -8,8°C con una máxima de -4°C y una mínima de -14,7°C. La HM al aire libre fue del 77%, con un máximo del 88% y un mínimo del 62%. Durante el mismo período, la temperatura interior media fue de 20,1°C, con una máxima de 20,4°C y una mínima de 19,8°C, mientras que la HM fue de 35%, con una máxima de 37% y una mínima de 34%.
DISCUSIÓN
El propósito de este estudio fue realizar un proyecto de demostración para evaluar si el almacenamiento prolongado en un ambiente de clima controlado reduciría el riesgo de alimentos contaminados con virus en comparación con el almacenamiento al aire libre durante el invierno de Minnesota. Bajo las condiciones del estudio, estos datos demuestran que en los 5 ingredientes evaluados del alimento, el protocolo de almacenamiento en interiores inactivó con éxito 3 patógenos importantes de los cerdos, incluidos PRRSv-174, PEDv y SVA. Por el contrario, los 3 virus sobrevivieron en los 5 ingredientes después del almacenamiento externo. Según los datos ambientales recopilados durante el almacenamiento en interiores, el área de almacenamiento se mantuvo a una temperatura cálida constante (media de 20,1°C) con una HM baja (media de 35%) durante los 30 días. En contraste, el ambiente exterior fue generalmente frío (media de -8,8°C) y húmedo (HM de 77%) y varió con el tiempo. Estos parámetros ambientales contrastantes probablemente jugaron un papel importante en la capacidad de los 3 virus para sobrevivir durante sus respectivos períodos de almacenamiento.
Si bien los resultados son prometedores, este estudio tuvo su parte de fortalezas y limitaciones reconocidas. Las fortalezas incluyeron la novedad del proyecto de demostración (condiciones de almacenamiento en el mundo real), el uso de múltiples réplicas por ingrediente del alimento y la inclusión de controles negativos para confirmar que no se produjo contaminación cruzada. Una limitación significativa del estudio fue que se realizó solo una vez y no se puede predecir una evaluación de la repetibilidad o consistencia de los resultados. Esto es importante ya que los datos de una única réplica no nos permiten determinar la eficacia del protocolo en todos los casos; es decir, no podemos decir que el protocolo probado eliminará la infectividad del virus el 100% del tiempo. Otras limitaciones incluyen el uso de una sola concentración viral para inocular las muestras de ingredientes y el uso de un tamaño de muestra pequeño, y pequeñas cantidades (30g) de 5 ingredientes alimenticios enriquecidos con volúmenes relativamente grandes de inóculo líquido. Si bien se utilizaron pequeñas cantidades para minimizar el riesgo de resultados falsos negativos, se están realizando estudios para repetir este proyecto utilizando mayores volúmenes de ingredientes inoculados con volúmenes proporcionalmente representativos de inóculo líquido.
Finalmente, este estudio evaluó un protocolo de almacenamiento en interiores que solo incorporó una configuración de tiempo y temperatura, y el estudio se llevó a cabo en un lugar en EE.UU. Durante una temporada del año. Se deben realizar más estudios utilizando diferentes condiciones para desarrollar una base de datos que compare el éxito de los diferentes protocolos de almacenamiento extendidos en diferentes entornos, así como la repetibilidad de los resultados.
En las condiciones de este estudio, los resultados demostraron que un período de almacenamiento prolongado de 30 días a una temperatura de 20°C fue eficaz para reducir la viabilidad de 3 patógenos virales importantes de los cerdos a través de múltiples ingredientes del alimento. Se espera que esta información apoye la aplicación adicional de procedimientos de almacenamiento extendidos en granjas y molinos. Por último, deben realizarse más estudios utilizando otros patógenos de enfermedades animales extranjeras importantes, como el virus de la PPA el virus de la fiebre aftosa, para justificar aún más los costes adicionales y la logística de implementar este enfoque.
IMPLICACIONES
Bajo las condiciones de este estudio:
- Un protocolo específico de almacenamiento prolongado inactivó PEDv, PRRSv y SVA.
- Todos los virus sobrevivieron en los 5 ingredientes almacenados en condiciones de clima frío.
- El almacenamiento extendido de alimento debe involucrar un ambiente de clima controlado.
Fuente: Anaporc
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